多平台、多方法DNA文库制备


自DNA被证明是生命体的遗传物质以来,科学家们对DNA的探索热情愈加高涨。1953年沃森和克里克发现DNA分子双螺旋结构,让人类对生命的认识有了重大的突破,从而带动了DNA测序技术的大发展。

 DNA测序技术的发展里程碑

从1977年第一代测序技术(Sanger法)到2005年Roche公司推出第一台基于焦磷酸测序的二代测序仪开始,到2017年Illumina推出NovaSeqTM系列,再到2018年MGISEQ-T7超高通量测序仪,测序技术至今已经历了四十多年的技术发展过程。


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注:图片来源于网络



 二代测序技术平台

第二代测序技术也叫高通量测序技术(NGS),其核心原则是边合成边测序。二代测序主要特点是一次能对几十万甚至几百万条DNA序列进行同时测定,使转录组测序及基因组深度测序变得高效、便捷,在保持高准确性的同时降低了测序成本,提高了测序的速度;但其测序的理论基础仍然建立在PCR扩增的基础之上,从而会引入PCR扩增带来的偏差,而且读长较短的缺点。现有的技术平台主要包括Illumina公司的Hiseq平台、Thermo fisher公司的Ion Torrent平台和华大MGISEQ平台,其中市场占比中illumina测序仪在全球的占有率高达83.9%。


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illumina测序原理(来源:illumina官网)


随着高通量测序技术的飞速发展,对测序质量和通量的要求越来越高,二代测序主要包括文库构建、上机测序、数据输出这几个流程。其中,DNA文库构建是二代测序技术的基础,高效简洁的建库方法可以提高整个测序流程的效率,其基本原理就是将待测样本片段化成小片段,再在其两端加上接头。根据样本片段化方式及添加接头方式的不同,常见的建库方式有以下几种:


常规法DNA建库

传统DNA建库具有适用样品类型广泛,文库转化率高的特点,是目前较常用的DNA二代测序文库构建方法。该方法主要通过TA克隆的方式连接接头,具体建库流程如下:

 待测序DNA片段化

 片段化的DNA进行末端修复和加A尾

 修复后的片段进行接头连接

 文库扩增

全式金目前已推出2款分别适用于Illumina和MGI平台的传统文库构建试剂盒,适用于全基因组、靶基因、宏基因组等多种测序。

 TransNGS® DNA Library Prep Kit for Illumina®

该产品针对Illumina 高通量测序平台开发,适用于将1 ng-1 μg 片段化的dsDNA 高效快速地转化为测序文库,具有文库转化效率高,适用样本类型广泛的特点。


 文库构建原理示意图

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 与竞品的比较

 不同起始样品量文库产量比较

分别使用TransGen和Company K产品,对来源于人血的不同起始量基因组DNA片段化后的dsDNA进行建库,结果表明,TransGen产品对1 ng-1 μg起始样品量均有较高的建库效率。


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 测序结果比较

分别使用TransGen和Company K产品,对100 ng来源于人血、人肺FFPE样品和水稻叶片三种基因组DNA片段化后的dsDNA进行建库测序及分析,结果表明,TransGen产品在数据质量、GC分布及相关性方面与竞品相比,性能一致。

 测序数据质量


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 GC分布


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 染色体覆盖深度分布


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 SNP分析


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 相关性分析


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 TransNGS® DNA Library Prep Kit for MGI®

该产品是针对MGI 高通量测序平台开发的文库试剂盒,具有文库转化效率高,适用样本类型广泛,数据质量高的特点。

 文库构建原理示意图


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 与竞品的比较

 不同起始样本量文库产量比较

分别使用TransGen和Company V产品,对来源于人HeLa细胞的不同起始量基因组DNA片段化后的dsDNA进行相同循环数的建库。结果表明,TransGen产品对1 ng-1 μg起始样本量均有较高的建库效率。


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 测序结果比较

分别使用TransGen和Company V产品,对来源于人Hela细胞的不同起始量基因组DNA片段化后的dsDNA进行建库测序及分析。 结果表明,TransGen产品在数据质量、GC分布及相关性方面与竞品相比,性能一致。

 测序结果比较


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 GC分布


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 染色体覆盖深度分布


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 SNP分析


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 相关性分析


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转座酶法建库

与传统文库制备必须进行DNA片段化、末端修复和接头连接相比,体外转座技术不仅快速、操作简便,而且建库所需DNA量少,5分钟内即可同时完成DNA片段化和接头连接。

针对不同的起始量样品,全式金推出3款Tn5建库产品

 TransNGS® Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 50 ng DNA)

 TransNGS® Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 5 ng DNA)

 TransNGS® Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng DNA)


 文库构建原理示意图

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产品稳定性

以5 ng人基因组DNA为样品,分别使用不同批次产品构建全基因组短片段文库,扩增9个循环,产物经1.0×DNA磁珠(TransGen, EC411)纯化(不进行文库片段长度分选),文库经Agilent高灵敏DNA芯片鉴定,片段长度分布一致,主要分布在200-2000 bp之间 ;使用Qubit检测文库浓度,计算文库产量。由峰型的一致性与产量的一致性上可知,产品批次间的稳定性好。


文库峰型与产量


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 与竞品的比较

以5 ng人基因组DNA为样品,分别使用TransGen和Company V产品构建全基因组短片段文库并进行文库测序及分析,结果表明,TransGen 产品在文库峰型与产量、测序数据质量、GC 分布与相关性方面与竞品相比,性能一致。


 文库峰型与产量


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 测序数据质量


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GC分布


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 相关性分析


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片段化酶法建库

相对于超声打断法,片段化酶法打断操作更为简单,转管次数更少,样本损耗量也更低,可以兼容更低的样本起始量。最重要的是,酶解法打断不需要使用专门的仪器和耗材,能大幅降低建库成本,因此全式金最新推出了2款适用于Illumina和MGI平台的片段化酶法建库试剂盒。

 TransNGS® Fragmentase DNA Library Prep Kit for Illumina®

该产品适用于将起始量为1 ng-1 μg的dsDNA高效快速地构建成DNA文库,一步完成DNA片段化、末端修复以及末端加A反应,产物无需纯化,可直接用于接头连接。


 文库构建原理示意图


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不同起始样本量文库产量比较

使用TransGen产品,以1 ng、10 ng、100 ng和500 ng起始量Hela细胞基因组DNA为模板,采用UDI长接头(TransGen, KI341)进行酶切法DNA文库构建,结果表明,文库产量均在1 μg左右。


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 不同物种样本文库产量

使用TransGen产品,对玉米、金黄色葡萄球菌、土壤微生物等不同类型样本进行建库,结果表明,文库产量均在1 μg左右。


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 测序结果比较

使用TransGen产品,以1 ng、10 ng、100 ng 和500 ng起始量Hela细胞基因组DNA为模板,采用UDI长接头(TransGen, KI341)进行酶切法DNA文库构建及分析。结果表明,TransGen产品对1 -500 ng起始量样本均可高效建库。

 测序数据质量


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 碱基含量分布


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 GC 分布


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 TransNGS® Fragmentase DNA Library Prep Kit for MGI®

该产品适用于将起始量为1 ng-1 μg的dsDNA高效快速地构建成DNA文库,一步完成DNA片段化、末端修复以及末端加A反应,产物无需纯化,可直接用于接头连接。


 文库构建原理示意图

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 与竞品的比较

分别使用TransGen和Company I产品,对200 ng人基因组标准品NA12878进行酶切法DNA文库构建,结果表明,TransGen产品在测序数据质量、比对率、SNP和InDel检出方面与竞品相比,性能一致。


 测序数据质量


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 SNP及InDel检出


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